摘要：目的使用超高效液相色谱-二极管阵列检测器检测法（UHPLC-DAD）和解吸电喷雾电离-离子化质谱成像技术（desorptionelectrosprayionization-massspectrometryimaging，DESI-MSI）对15批芍药甘草汤（Shaoyao-Gancao-Decoction，SGD）物质基准和对应实物进行分析，考察DESI-MSI在经典名方SGD质量控制中的优势。方法以SGD为研究模型，采用传统UHPLC-DAD法建立物质基准指纹图谱，并对SGD指标成分（芍药苷、甘草苷、甘草酸）含量、出膏率进行考察。同时，以芍药甘草汤对应实物冻干粉为研究载体，将其复溶后点样于定性滤纸，并固定于载玻片制成样品，以甲醇-甲酸（∶1）为喷雾溶剂，体积流量3μL/min；扫描范围m/z～；空间分辨率μm；喷雾气（N2）压力0.5MPa；离子源温度℃，采用正负离子全扫描样本。结果DESI-MSI法能检测到SGD指标成分芍药苷、甘草苷、甘草酸以及共有峰成分芍药内酯苷等。同时，DESI-MSI法还能检测到来自甘草、白芍的甘草皂苷G2、甘草皂苷J2、没食子酸、柠檬酸、对羟基苯甲酸等11种成分，并对其相对含量进行直观呈现，定性分析能力远强于UHPLC-DAD法。结论基于DESI-MSI技术无需进行复杂的样品前处理，可以在无对照品情况下进行复杂样品的定性、相对含量分析，灵敏度高，分析能力强，可以作为经典名方物质基准、对应实物及配方颗粒样品的质控研究方法。
芍药甘草汤（Shaoyao-Gancao-Decoction，SGD）源于张仲景之《伤寒杂病论》。该方组方精简，疗效显著，被历朝历代医家推崇，沿用至今，并且在其基础上加减化裁，用于治疗不同的病证，被广泛应用于古、现代中医临床[1]。现代药理学研究和临床实践也证实，SGD具有显著的解痉[2]、抗炎镇痛[3]、止咳平喘[4]、保肝利胆[5]、抗HBV病毒[6]、抗纤维化[7]、保护胃黏膜[8]、免疫调节[9]、以及抗过敏、通便、保护跟腱组织[10]等作用，对多种痉挛性疾病、疼痛性疾病、炎症性疾病以及支气管哮喘、帕金森病、便秘等都有显著的治疗作用[11-16]。作为第一批入选《古代经典名方目录》的复方，SGD的煎煮工艺及质量标准研究对于后续经典名方的开发具有一定的指导意义[17-18]。
高分辨质谱广泛应用于中药化学领域，其对复杂中药化学成分的定性定量研究，可以全面展现中药及其复方的药效成分，不仅为药理学研究提供合理参考，也为中药质量标准体系的构建提供关键依据[19-21]。质谱成像（massspectrometryimaging，MSI）作为一种新型分子成像技术，近年来多应用于药物及其代谢物体内分布研究，利用激光或离子束使样本表面分子离子化，通过串联质谱测定离子化分子质荷比，直接从动物组织切片表面获得药物及其代谢物在体内的分子组成、相对丰度与空间分布状况，并以彩色图像的形式表达[22-27]。如王中华等[28]应用敞开式空气动力辅助离子化-高分辨质谱成像技术对大鼠肾脏组织切片进行成像分析，得到38种肾脏内源性产物在组织中的特异性分布，直观体现了与肾脏渗透压梯度形成有关的多种小分子代谢物皮质-髓质轴向分布特征。
本研究以本课题组先前研究进展为基础[29]，以经典名方作为研究对象，参考《伤寒论》原文记载的制备方法制备15批SGD物质基准，建立基于超高效液相色谱（ultra-highperformanceliquidchromatography，UHPLC）的SGD物质基准特征图谱分析方法，同时制备对应实物，确定出膏率范围。并且以SGD对应实物为研究对象，建立了基于解吸电喷雾电离（desorptionelectrosprayionization，DESI）-离子化质谱成像技术（DESI-MSI）的经典名方质量控制方法，对多组分进行定性定量分析，为经典名方整体质量控制研究提供新思路、新方法。
1材料
InfinityII型超高效液相色谱仪，美国安捷伦公司，包括GB型自动进样系统，GB型柱温箱，GA型二极管阵列检测器（DAD）；XevoG2XSqtof.DESIMSI质谱成像系统，美国沃特世科技有限公司；BS-S型电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；LD-2型电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；H-W型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LGJ-10E真空冷冻干燥机，四环福瑞科仪科技发展有限公司；HDZ20型智能煎药壶，美味世家永达基电器厂，容量2L，额定功率W，稳定电压V。
对照品异甘草苷、新甘草苷、芹糖基甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草次酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、没食子酸甲酯、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、儿茶素、丹皮酚、苯甲酸、刺芒柄花素，批号分别为17121、、、、、18032、17085、17041、、、、、、61、、11401，质量分数均≥98%，成都普菲德生物技术有限公司；对照品芍药苷、甘草苷、甘草酸铵，批号分别为、L63P-J7XV、1802，质量分数依次为98%、93.1%、98%，购自中国食品药品检定研究院；水为娃哈哈纯净水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。SGD所用饮片均由盛实百草药业有限公司提供，经新疆农业大学食品科学与药学学院马生军副教授鉴定，饮片所用药材分别为毛茛科芍药属植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎，详细信息见表1。
2方法与结果
2.1SGD物质基准研究
2.1.1对照品溶液的制备精密称取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加甲醇分别配制成含芍药苷1.8mg/mL、含甘草苷1.0mg/mL、含甘草酸铵0.9mg/mL的3组单一对照品溶液（甘草酸质量＝甘草酸铵质量/1.），置于冰箱中，4℃保存，备用。
2.1.2SGD物质基准及供试品溶液的制备依据《伤寒论》原文记载以及相关文献报道[30-31]，取白芍四两（12g）、炙甘草四两（12g），以上2味药材置于煎药壶中，根据书中记载加水三升（mL）并将煎药壶置于加热盘上，武火煎煮至微沸，再调整至文火保持微沸继续煎煮，用目筛网滤过，得药液一升五合（mL），即得SGD物质基准，并编号S01～S15。精密吸取SGD物质基准0.8mL，精密加入甲醇0.8mL，涡旋充分混匀，0r/min离心5min，取上清液用0.22μm滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.1.3色谱条件ThermoAccucoreC18色谱柱（mm×2.1mm，2.6μm），流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～5min，5%～10%乙腈；5～10min，10%～15%乙腈；10～18min，15%～20%乙腈；18～25min，20%～25%乙腈；25～35min，25%～40%乙腈；35～36min，40%～95%乙腈；36～46min，95%乙腈；体积流量0.4mL/min；进样量3μL；柱温30℃；检测波长、nm。
2.1.4方法学考察
（1）线性关系考察：精密吸取“2.1.1”项下芍药苷对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6mL，分别移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定芍药苷的峰面积，以芍药苷进样质量浓度为横坐标（X），nm波长下峰面积为纵坐标（Y），计算得回归方程为Y＝.X－63.，r2＝1.。
精密吸取“2.1.1”项下甘草苷对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL，分别加至5mL量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定成分的峰面积，以甘草苷进样质量浓度为横坐标（X），nm波长下峰面积为纵坐标（Y），计算得回归方程为Y＝.X－.，r2＝1.。
精密吸取“2.1.1”项下甘草酸铵对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6mL，分别加至5mL量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定成分的峰面积，以甘草酸铵进样质量浓度为横坐标（X），nm波长下峰面积为纵坐标（Y），计算得回归方程为Y＝.X－1.25，r2＝0.。
（2）精密度考察：取同一批SGD供试品溶液（S03），按照“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD值分别为0.15%、0.09%、0.06%，表明仪器精密度良好。
（3）稳定性试验：称取同一批SGD饮片适量，按照“2.1.2”项下方法制备1批供试品溶液（S03），分别于配制后0、2、4、8、12、24h按照“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD值分别为0.54%、0.79%、0.83%，表明24h内供试品溶液稳定性良好。
（4）重复性试验：称取同一批SGD饮片适量，按照“2.1.2”项下方法平行制备6批供试品溶液（S03），按照“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵质量浓度的RSD值分别为0.79%、0.77%、0.46%，表明本方法重复性良好。
（5）加样回收率试验：精密称取已知各指标成分含量的SGD物质基准（S03），分别加入等量芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，结果3者平均加样回收率分别为.73%、.44%、99.51%，计RSD值依次为0.54%、0.79%、0.83%。
2.1.5样品测定精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件测定，计算物质基准中芍药苷、甘草苷、甘草酸铵含量。结果见表2。
2.1.6SGD出膏率研究精密吸取混合均匀的“2.1.2”项下SGD物质基准10mL于蒸发皿中，40℃真空干燥至恒定质量，称量质量，根据出膏率公式计算物质基准出膏率。见表2。
出膏率＝wV/(vM)
M表示药材质量，V表示SGD物质基准体积，v表示取样体积，w表示取样所得干膏质量
2.1.7SGD物质基准UPLC-DAD特征图谱研究将“2.1.5”项下SGD物质基准色谱信息输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（版）进行分析，设置SGD物质基准S01为参照图谱，全谱峰匹配，见图1。结果显示共有峰21个，指认4个。15批SGD物质基准与对照特征图谱的相似度均＞0.9，符合指纹图谱相似度要求。
2.2SGD对应实物DESI-MSI研究
2.2.1SGD对应实物供试品溶液的制备按照“2.1.2”项下煎煮工艺以及表1中白芍和炙甘草饮片的配伍重新煎煮15批SGD。每批汤剂分别精密量取5mL置于10mL罗口瓶中，使用冷冻干燥机冷冻干燥成SGD冻干粉，即对应实物。向罗口瓶中加入适量50%甲醇使对应实物复溶，将复溶液完全转移至5mL量瓶中，超声10min后冷却至室温，用50%甲醇定容，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得SGD对应实物供试品溶液。
2.2.2对照品样本制备取芍药苷、甘草苷、异甘草苷、新甘草苷、芹糖基甘草苷等19种对照品适量，分别置于10mL量瓶中，甲醇定容，摇匀后，使用5μL定量毛细管在定性滤纸上分别点样，晾干后，打孔器在点样中心位置打孔，并将打下的圆片附在已贴好双面胶的载玻片上，见图2-A。
2.2.3SGD对应实物样本制备取“2.2.1”项下15批SGD对应实物甲醇复溶液，使用5μL定量毛细管在定性滤纸上点样，晾干后，打孔器在点样中心位置打孔，并将打下的圆片附在已贴好双面胶的载玻片上，见图2-B。
2.2.4质谱条件解吸电喷雾电离离子源（DESI），可加热至℃定制毛细管；灵敏度模式下操作，正负离子全扫描，扫描范围m/z～；空间分辨率μm；喷雾电压3kV；采样锥电压?40V；喷雾器（氮气）压力0.5MPa；溶剂为甲醇-甲酸（∶1），体积流量3μL/min；喷雾器入射角60°；收集角10°；总采集时间min；离子源温度℃；采样锥电压?40V；数据采集采用HDImaging软件（美国Waters公司）。
2.2.5定性分析采用XevoG2XSqtof.DesiMSI方法，按照“2.2.4”项下质谱条件对对照品样本和SGD对应实物样本进行分析，图3为正、负离子模式下分别测定的SGD对应实物样本的总离子流图。通过比对对照品样本质谱成像结果及参考相关文献报道[32-39]，确定各成分分子离子质荷比。
（1）指标成分及共有峰DESI-MSI分析：根据对照品样本的质谱成像结果并参考相关文献，可以确定质荷比为m/z.的分子离子源于甘草苷及其同分异构体；m/z.的分子离子源于甘草酸，m/z.9和m/z.的分子离子源于芍药苷及其同分异构体，见图4。图4-A为甘草苷及其同分异构体新甘草苷、异甘草苷（m/z.）在对应实物样本中的含量分布；图4-B为甘草酸的离子碎片（m/z.）在对应实物样本中的含量分布；图4-C、D为芍药苷及其同分异构体芍药内酯苷（m/z.9和m/z.）在对应实物样本中的含量分布，指标成分质谱图见图4-a～d。其他DESI-MSI详细分析结果见表3。
（2）其他成分DESI-MSI分析：除指标成分与共有峰中可定性的成分外，查阅相关文献报道[32-39]，还在SGD物质基准样本的分析结果中发现了多个已知化学成分。其在对应实物样本中的相对含量分布情况见图5、6。具体DESI-MSI详细分析结果见表3。
2.3结果分析
各批次SGD物质基准中指标成分质量分数分别为芍药苷0.51～0.76mg/mL、甘草苷0.07～0.32mg/mL、甘草酸0.15～0.53mg/mL，其中部分成分含量在不同批次中差异较大，除所用不同产地不同批次的饮片质量不同等原因外，在制备过程中，所选取饮片的形状、大小、以及所用饮片的取材部位都是造成物质基准质量波动的主要原因。物质基准-对应实物的出膏率为19.33%～27.75%，平均出膏率为24.09%，标准偏差（RE）为2.02%。特征图谱研究表明，按照中医古籍中记载的制备工艺所制的SGD物质基准具有极高的相似性，相似性均＞0.9，确定共有峰共有21个，指认4个，分别为芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷、甘草酸，在对照特征图谱中分别对应5、4、9、21号色谱峰。在后续研究中，将继续对SGD对应实物进行系统研究，在相同色谱条件下测量指标成分含量并绘制指纹图谱，同时计算物质基准-对应实物之间指标成分的转移率，以期为后期经典名方制剂的研发提供中间体调配方法的制定依据。
本研究应用DESI-MSI技术对SGD对应实物进行定性分析，在部分对照品缺失的情况下依然能够准确对其中14个成分进行定性，定性分析结果明显优于UHPLC-DAD法。但是，在有对照品的情况下，UHPLC-DAD法可以进行定量与定性分析，而DESI-MSI定量能力却不及UHPLC-DAD法，二者各有优势。
3讨论
SGD组方精简，仅由白芍和炙甘草2味药材组成，因此在指标成分的选择上参考版《中国药典》中白芍和炙甘草的含量测定要求，选择芍药苷、甘草苷、甘草酸作为指标成分。
传统UHPLC作为高度稳定、可靠、重现性好的分离技术，广泛应用于中药质量标准研究，但在化学成分复杂的中药复方研究上，仍存在不可避免的局限性。本研究中UHPLC针对SGD建立专属性强的特征图谱，为经典名方质量标准研究提供了有意义的参考。
MSI技术常用于动植物组织切片的成像研究，本研究将该技术应用于经典名方质控研究。该技术取样量少、预处理相对简单，4h即可完成15批SGD对应实物的样品分析（正、负离子模式下），远远小于UHPLC-DAD的分析时间（15批SGD物质基准共计分析11.5h）。对比分析结果，DESI-MSI获得数据信息量远大于UHPLC-DAD，还可通过复方中单味药的单煎、阴性对照等方法确定各药味在复方中的专属性化学成分，从而在无对照品的情况下，快速完成对经典名方等复方制剂的质控。本方法无需考虑流动相选择、浓度梯度设置、色谱柱分离能力、检测器适用性等常规分析手段中常见的问题。
DESI-MSI虽无法对指标成分做到精确定量，但仍可通过参考各批次样品中指标成分的响应值，半定量分析比较指标成分在不同样品间的含量关系。即便如此，DESI-MSI仍提供了大量的结构信息，后续可通过比较复方在DESI-MSI下各单味药单煎-合煎的成分分布关系，结合药物及其代谢物在给药动物组织切片中的分布，确定药效成分来源及作用靶点，为经典名方质量标准体系的搭建筛选更为合理的指标成分，也为后期药效物质基础研究奠定基础。
研究过程中部分操作仍可改进，由MSI图谱可以看出部分成分在样本圆片上分布不均，影响了分析结果直观性，本研究虽已选择用于纸色谱的定性滤纸作为样品支持物，但仍存在由于纸纤维分布不均导致样品扩散不均匀的现象。同样，在样本制作过程中人为打孔位置、点样方式的选择等问题，都会对化学成分在样本上的分布造成影响，可见研制DESI-MSI配套的标准点样仪与点样板是十分必要的。本研究仅对样本进行了一级结构分析，分析结果受同分异构体影响，后续将研究二级甚至三级结构的分析是否对分析结果有较大改善。
参考文献（略）
来源：曲缘章,孙博,朱广伟,马生军,李宝国．DESI-MSI技术在经典名方芍药甘草汤质量控制中应用研究[J].中草药,,51(12):-.
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